Wer hat sich bei einem Museumsbesuch nicht schon einmal vorgestellt, wie es wäre, wenn die Ausstellungstücke zum Leben erwachen würden, wenn sich die Mumien plötzlich erheben würden, die Dinosaurier-Knochen durch die Gänge stapfen würden und die Statuen berühmter Männer und Frauen auf einmal sprechen würden.

Larry Daley (Ben Stiller) war schon eine ganze Weile nicht mehr in einem Museum und ob er sich jemals vorgestellt hat, dass die Exponate zum Leben erwachen könnten ist fraglich, denn Larry hat eine ganze Menge anderer Probleme, mit denen er sich rumschlagen muss.
Da er es nicht auf die Reihe bekommt einen festen Job zu finden und seine zahlreichen Erfindungen niemals erfolgreich wurden, steht er kurz davor schon wieder seine Wohnung zu verlieren. Außerdem setzt ihn seine Ex-Frau Erica (Kim Raver) unter Druck. Sie will ihm verbieten seinen geliebten Sohn Nick (Jake Cherry) zu sehen, falls er es nicht schafft einen regulären Job zu bekommen und endlich ein geregeltes Leben zu führen.
Also beschließt Larry den erstbesten Job anzunehmen, den er kriegen kann – und das ist zufällig eine Stelle als Nachtwächter im New Yorker Museum Of National History. Er soll die etwas kauzigen, in die Jahre gekommenen Nachtwächter Cecil (Dick van Dyke), Gus (Mickey Rooney) und Reginald (Bill Cobbs) ersetzen.
Larry nimmt den Job mit relativ wenig Begeisterung an und stellt sich auf eine langweilige erste Nacht ein. Was ihm Cecil jedoch verschwiegen hat ist der unbedeutende Umstand, dass nachts im Museum das gesamte Inventar durch einen ägyptischen Fluch zum Leben erwacht. So ist Larry auch mehr als schockiert, als plötzlich das riesige Skelett des T-Rex verschwunden ist und er von einer Horde wilder Hunnen angegriffen wird. Aber auch alle anderen Ausstellungsstücke toben mit einem Mal wie wild durch die Räume des Museums. Will Larry seinen Job nicht wieder verlieren muss er dafür sorgen, dass am nächsten Morgen alle wieder unversehrt an ihrem Platz stehen und er selbst nicht von den Löwen gefressen oder den Hunnen gevierteilt wurde. Der einzige Verbündete in diesem Chaos ist die Wachsfigur von Theodore Roosevelt (Robin Williams), der sich unsterblich in die schöne Indianerin Sacajawea verliebt hat.
Doch die wild gewordenen Relikte aus der Vergangenheit sind nicht Larrys einziges Problem. Auch die ehemaligen Nachtwächter führen böses im Schilde und müssen von Larry aufgehalten werden.

Nachts im Museum verzaubert einerseits durch die großartigen CGI-Effekte, die das vermeintlich verstaubte Inventar des Naturkundemuseums tatsächlich zum Leben erwecken. Jedoch wäre der Film ohne das Talent einiger der besten amerikanischen Komiker bei weitem nicht so dynamisch, witzig und temporeich. Allen voran ist natürlich Ben Stiller zu nennen, der als Taugenichts Larry wieder einmal in Hochform ist und sich durch das zum Tollhaus transformierte Museum albert. Aber auch Robin Williams kann mit seiner Darstellung des ehemaligen US-Präsidenten Theodore Roosevelt eine großartige Performance abliefern. Das größte Vergnügen bereiten jedoch die Szenen mit Owen Wilson, der als Miniatur-Cowboy Jedidiah einen unerbitterlichen Kampf gegen den Römer Octavius (Steve Coogan) vom Diorama nebenan führt.
Nachts im Museum ist eine Verfilmung des Kinderbuchs "The Night At The Museum" des kroatischen Autoren Milan Trenc. Der Regisseur dieses 100 Millionen-Dollar teuren, actionlastigen CGI-Spektakels ist der Comedy-Spezialist Shawn Levy, der bereits für Im Dutzend billiger (2003) und Der rosarote Panther (2006) Regie geführt hat. Entstanden ist daraus ein etwas fantastischer, massenkompatibler Familienfilm, der insbesondere den kleineren Zuschauer eine Menge Spaß machen wird.
Damit ist Nachts im Museum insgesamt ein witziger Popkorn-Kino-Spaß, der - lässt man sich auf die Story ein - einen beträchtlichen Unterhaltungsfaktor bietet und möglicherweise sogar die jüngeren Zuschauer dazu anregt auch mal ein echtes Museum besuchen zu wollen.